Tento objev představuje, že byl C. perfringens typu B poprvé detekován u člověka.
Tropismus (orientace dle stimulace) epsilon toxinu na hematoencefalickou bariéru a vázání se na oligodendrocyty/myelin z něj dělá provokativního kandidáta na vznikající formace lézí u roztroušené sklerózy.
Prozkoumali jsme dobře popsanou populaci RS pacientů a zdravých lidí na nošení toxino-typů C. perfringens v zažívacím traktu.
Lidská komenzální(žijící v symbióze) Clostridium perfringens typu A byla přítomna u 50% zdravých lidí v porovnání s 23% pacientů s RSkou.
Prozkoumali jsme sérum a mozkomíšní mok získaný ze dvou tkáňových bank a objevili jsme, že imunoreaktivita na ETX je 10x více běžnější u lidí s roztroušenou sklerózou než u zdravých lidí, což naznačuje dřívější vystavení se ETX u populace s roztroušenou sklerózou.
C. perfringens epsilon toxin se mechanistikálně shoduje s rodícími se formacemi lézí neboť tyto léze jsou charakterizovány propustností hematoencefalické bariéry a buněčnou smrtí oligodendrocytů v nepřítomnosti adaptivního imunitního pronikání.
Úvod
Jak začíná roztroušená skleróza zůstává neznámé. Zkoumané prvotní léze, v určitých hodinách po propuknutí symptomů, vykazují propustnost hematoencefalické bariéry, apoptózu(smrt) oligodendrocytů, a dřívější mikrogliální aktivaci. V těchto lézích ještě není demyelizace zřejmá nejsou tuky-zatížené makrofágy a je tam zřetelná absence infiltrujících lymfocytů. Absence zánětlivé infiltrace v počátečních lézích je argumentem proti tomu, že roztroušená skleróza začíná jako autoimunitní fenomén a místo toho je preferována toxinová nebo virová etiologie (příčina-následek). My odůvodňujeme, že spouštěčem z prostředí pro prvotní formaci lézí u roztroušené sklerózy by mohl být rozpustný toxin dle histopatologických rysů začínajících lézí.
C. perfringens je gramopozitivní, spóry formující anaerobní baktérie která je dělena na pět toxinotypů založených na kombinatorickém přenosu α, β, ε a ι toxinů. C. perfringens typu B a D nese ETX gen, který enkóduje 33kD protoxin.
V růstové fázi kmenu bakterie je vylučován protoxin a štěpený trypsinem a chymotrypsinem v zažívacím traktu nebo C. perfringens nekódovanou λ-protease což vytváří aktivní toxin 1000x silnější než protoxin.
Přirozenými hostiteli C. perfringens toxinotypu B a D jsou přežvýkavci u kterých ETX-zprostředkované neurologické symptomy nastávají když potrava bohatá na karbohydráty (cukry) nebo více pastvy nahrává exponenciálnímu růstu této bakterie. ETX je absorbované přes střeva, vstupuje do krevního toku a způsobí propustnost hematoencefalické bariéry, což vede k symptomům podobným roztroušené skleróze (vizuální dysfunkce, koordinace a spastická paralýza). Murell a kolegové díky těmto účinkům na CNS poprvé naznačili že ETX je možný spouštěč roztroušené sklerózy ačkoliv člověk není přirozený hostitel pro baktérie C. perfringens typu B nebo D.
ETX se váže na neznámý receptor přítomný v mozkových cévách a v myelinovaných mozkových oblastí například corpus callosum. Jakmile se naváže na jeho receptor, tak se ETX integruje do plazmové memrány jako heptameric pore, což vede k osmolysis. Když bylo ETX zkoumáno na hlodavcích tak došlo k narušení hematoencefalické bariéry a především cévnatá bílá hmota byla zranitelná. Zajímavé bylo, že intraperitoneální podání protoxinu u krys vedlo ke zformování ohniskových vejčitých lézí uvnitř corpus callosum ve kterém delší osy těchto vejčitých lézí byly orientovány kolmo k ploše ventriculus lateralis.
My tvrdíme, že Clostridium perfringens epsilon toxin může být možný toxin způsobující počáteční formace lézi v eresce pro další výzkum.
Metody
Etické prohlášení
Výzkumný protokol #1003010940 pro sběr vzorků od jedinců s roztroušenou sklerózou a zdravých lidí byl zhodnnocená a schválený od WCMC institutional review board. Všichni pacienti ve studii dali písemné svolení.
Fluorescentní označování ETX a Imunofluorescence
(Do překladu metod se raději pouštět nebudu, Protože jsem zjistil, že se některá běžná slova a předložky používají v jiném významu - například jako registrované značky pro bílkoviny a metody společnosti která vyrábí fluorescentní značkování buněk v těle a pod.)
Výsledky
Identifikace Clostridium Perfringens typu B u ženy s roztroušenou sklerózou
U 21 leté ženy se vyvinula diskoordinace a nerovnováha dolní končetiny na maximální deficit během tří dnů. Dva týdny po propuknutí onemocnění to řekla neurologovi diky přetrvávajícím problémům. Neuro-zobrazení mozku odhalilo několik ohnisek zvětšujících se T2 lézí hluboko v bílé mozkové hmotě s několika vejčitými lézemi uvnitř kalózních tělesech, které jsou charakteristické pro roztroušenou sklerózu. Po podání gadolinia IV, bylo několik lézí vylepšených(asi že se ukázaly). Analýzy mozkomíšního moku odhalily pět IgG proužků na isoeletrickém zaměřování, které nebyly přítomny v příslušném krevním vzorku. (můj komentář - tzn. že byly přítomny jen v mozku). Takže pacientka splnila revidované kritéria pro klinicky definitivní roztroušenou sklerózu v jejím nejpočátečnějším projevu označeném jako klinický izolovaný syndrom CIS. Dostala 5 dní methylprednisolone, 1 gram denně, a její symptomy odezněly do normální neurologické funkce během tří týdnů. V centru roztroušené sklerózy Weill Cornell jí byla potvrzena diagnóza a byla seznámena s léčebným plánem. Opakované neurozobrazování na Weill Cornell odhalilo léze charakteristické v morfologii a umístnění pro roztroušenou sklerózu. Přibližně tři měsíce po propuknutí symptomů se přihlásila do studie HITMS a byly získány vzorky stolice nasbírané pacientkou. Byla zahájena nemoc modifikující léčba. 8 měsíců po zahájení léčby zůstávala bez příznaků a její první hodnocení na magnetické rezonanci bylo provedeno a odhalilo několik nových zvětšujících se lézí.
(obrázek 1B–F).
léze (obrázek 1B–F).
Tři měsíce po propuknutí jejích symptomů, byla u pacientky v trávicím traktu nalezena bakterie C. perfringens typu B. PCR analýzy odhalily nošení genu enkódujícího toxiny α, β, a ε (obrázek 2A). To je první člověk o kterém se ví, že nosí typ B a první RS pacient u kterého se objevilo, že nosí ETX produkující baktérie C. perfringens. Proto aby jsme vyloučily možnou odvozenou laboratorní kontaminaci, tak jsme provedli "lysogenic bacteriophage" stopové analýzy z laboratoře (ATCC 3626) a z kmenů bakterií C. perfringens získaných z pacienta.
Tři "lysogenic bacteriophage" vzorky byly identifikované na laboratorním kmenu, který se shodoval se známou sekvencí genomu. (obrázek 2B). Kmen pacientky obsahoval právě dva vzorky "lysogenic bacteriophage", a tím se potvrdilo, že z pacientky odebraný ETX amplicon nebyla labolatorní nečistota (obrázek 2B). Neboť kombinace toxinotypů C a D by mohla také vyústit k identifikaci genů toxinu α, β, a ε , tak jsme sekvencovali ETX gen získaný z pacienta což potvrdilo že byl odvozený z typu B ETX.
K tomu aby jsme dále dokázali, že detekce C. perfringens z pacientky byla opravdu z jedinečného kmenu, tak jsme pro analýzu generovali čisté kolonie. Tekuté RPM kultury ze vzorků stolice od pacientky byly vloženy do TSC agar. (TSC agar - je mikrobiologický test. A protože o tomto testu nic nevím, tak tento odstavec nebudu překládat)
.....
Obrázek 6: ETX se váže konkrétně na cévy oční sítnice a na myelin
A/ zmražené sekce oční sítnice dospělé myši byly barveny s cévním markerem FITC označujícím BSL1 (zeleně) a Alexa 594 označujícím ETX (červeně)
(moje pozn. zeleně jsou označeny cévy, červeně kde se nachází toxin, a třetí obrázek je průnik)
B/ zmražené vertikální sekce z mozku dospělé myši kalózních těles byly obarveny proteolipidovou bílkovinou (PLP, zeleně) a Alexa 594 označujícím ETX (červeně)
http://www.plosone.org/article/info%3Ad ... ne.0076359
Pojmy:
grampozitivní baktérie - mají na konci diagnostického barvení podle Gramovy metody pod mikroskopem modrofialovou barvu. Tento fakt je zapříčiněn vysokým obsahem peptidoglykanu v buněčné stěně a absencí vnější membrány a lipopolysacharidové vrstvy.
Anaerobní je takový proces nebo prostředí, kde není přítomen vzdušný kyslík
protoxin - látka ze které se toxin teprve stane.
